光动力疗法的生物学效应

光动力疗法的生物学效应

PDT 已成为肿瘤、鲜红斑痣和老年性眼底黄斑变性等疾病的重要治疗手段；应用 PDT 治疗动脉粥样硬化、血管成型术后再狭窄、类风湿关节炎滑膜切除、牛皮癣和增殖性瘢痕的研究均已进入临床阶段；此外， PDT 在抗病毒（如血液净化）、战伤清创和 DNA 定位切割等方面的研究亦显示出可喜的苗头。 PDT 治疗这些疾病的的细胞学、生物学基础和机制是什么， PDT 的治疗作用受那些因素影响以及如何调控， PDT 作为一种治疗方法有那些特点，这些都是 PDT 使用者所必须了解的内容。

光动力反应中生成的活性氧物质有很高的化学反应活性，能与多种细胞成分相互作用，如蛋白质、脂质和核酸等对单线态氧很敏感，某些有机酸、醇、胺、碳水化合物、含氮杂环分子、激素、吡咯、维生素和细胞因子等也能与其发生反应。因此，在理论上光动力疗法能产生多种多样的生物学效应，具有广泛的用途。目前在临床治疗中主要是利用 PDT 对靶细胞的杀伤作用。

一、细胞杀伤作用

? 细胞杀伤的机制

1. 直接损伤

就大多数光敏剂而言，细胞膜、线粒体和溶酶体是对 PDT 最敏感的亚细胞结构，其他细胞器如内质网、微管、核糖体、细胞核等也可都可能受到损伤破坏。当细胞结构的损伤破坏达到不可修复的程度时，细胞就会死亡。

（ 1 ）细胞膜

细胞膜的主要成分是脂质和蛋白质，两者对光敏作用都很敏感。 PDT 可引起膜蛋白酞链内、酞链间的共价交联， Na + /K + ATP 酶、 Mg ++ ATP 酶、 5\'- 核苷酸酶等多种与膜结合的酶失去活性，导致膜转运功能障碍，核苷和氨基酸转运被抑制，钙、钠离子进入细胞增加，镁、钾离子外流。 PDT 可使细胞膜脂质过氧化物积聚，脂膜流动性降低。单态氧使膜脂中不饱和脂肪酸被氧化成丙二醛，破坏膜结构的完整性，可引起红细胞溶血反应。

（ 2 ）线粒体

培养细胞经 HpD 短时间处理后照光，主要表现为细胞膜损伤，而 HpD 长时间处理后，较多的 HpD 定位于线粒体，据信线粒体是通过多种特异和非特异的受体来摄取 HpD 的。照光引起线粒体的显著破坏，线粒体的呼吸活动和氧化磷酸化中断、钙离子摄取被抑制，线粒体肿胀，线粒体膜破裂。 PDT 作用后大鼠 R3230AC 乳腺癌细胞体外分离线粒体的细胞色素 C 氧化酶、琥珀酸脱氢酶、质子转位 FOF1 ATP 合成酶 (proton translocating FOF1 ATP synthase) 、 NADH 脱氢酶的活性受到抑制，但异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 NAD- 苹果酸脱氢酶的活性不受影响。线粒体外膜上的单胺氧化酶被抑制，而位于线粒体内外膜之间的腺苷酸激酶对 HpD-PDT 不敏感。有报告各种线粒体酶对卟啉 -PDT 的敏感程度依次为：内膜 > 外膜酶 > 膜间基质酶，敏感的酶都位于心理体膜上而不是在线粒体基质中，这也提示光敏剂主要聚集于线粒体疏水性较强的膜上，细胞器的疏水性成分对 PDT 更为敏感。 PDT 后细胞内 ATP 水平下降。用 31 P NMR 光谱学检测体内的肿瘤细胞、正常猫脑和小鼠乳腺癌，都见到类似的 ATP 水平显著下降的现象，且与药物浓度和照光剂量呈依赖关系。

（ 3 ）细胞核

PDT 对细胞核有一定的损伤作用。即使是在细胞核内无分布的 HpD 和酞菁类光敏剂，仍能破坏 DNA 中鸟嘌呤，引起 DNA 发生单链断裂和形成一些单链区， DNA 单链断裂和姐妹染色单体交换、 DNA- 蛋白质交联等改变。研究表明， DNA 在细胞有丝分裂期的中期附着在核膜上， HpD 和酞菁类光敏剂在核膜上有分布，可在此时损伤 DNA 。

DNA 损伤涉及到 PDT 是否有致癌突变的问题。但迄今尚未见到肯定 PDT 有致癌突变的报道。许多研究表明， PDT 引起的染色体畸变率低于放射线，引起的姐妹染色单体交换也比紫外线低。低剂量 HpD-PDT 对细胞增殖的抑制作用仅持续数小时，随即恢复正常， DNA 合成抑制在 24 小时内可逐渐恢复到正常水平，表明 DNA 损伤的可修复性。

（ 4 ）溶酶体

有报告光敏剂可通过受体结合进入细胞后积聚于溶酶体内， PDT 引起溶酶体损伤，使其释放出酸性磷酸酶、 β- 透明质酸酶、芳基酰胺酶、 β- 半乳糖苷酶、 β-N- 乙巯氨基葡糖苷酶等一系列溶解酶，引起细胞自溶。但也有人提出溶酶体酶对 PDT 的敏感性低于线粒体酶，溶酶体酶的失活早于释放，还发现溶酶体酶的抑制剂不能保护细胞免于破坏，主张光敏杀伤细胞主要不是有溶酶体损伤引起的。

（ 5 ）微粒体

PDT 作用后细胞色素 P-450 迅速降解并失去亚铁血红素，一些单样酶如芳香烃羟化酶和乙样基香豆素 -δ- 脱乙基酶也被显著抑制。大鼠经 HpD 处理后分离肝细胞在体外照光，显示脂质过氧化反应加剧。这些都提示微体损伤可能参与细胞光敏损伤过程。

（ 6 ）内质网

酰基 - 辅酶 A ：胆固醇 -O- 酰基转移酶定位于内质网膜，是胆固醇代谢的一种关键酶，人肺成纤维细胞在 PDT 作用后数分钟，此酶的活性就显著降低，提示 PDT 引起内质网的损伤改变。

（ 7 ）微管

有些光敏剂如 P II 、 TPPS 、 AlPcS 4 等对细胞分裂有抑制作用，使其停留在有丝分裂中期。研究显示这是由于纺锤体的微管异常所致。在丝分裂中期，星体、纺锤体和染色体组装成有丝分裂器。由于微管损伤，有丝分裂器的组装受阻，细胞不能进入有丝分裂后期。微管损伤的机制还不清楚。有人提出纺锤体的损伤可能是溶酶体损伤后泄出的担保酶作用的结果，但也有人认为可能由于直接作用于管蛋白或其他的微管相关蛋白所致。有报道光敏剂 TPPS-PDT 对微管成分的再聚合功能有直接的影响。

2. 缺血损伤

PDT 对照射区域微血管的封闭作用是导致靶细胞损伤的另一重要机制。电镜研究观察到，人膀胱癌组织毛细血管内皮细胞的损伤在光照结束后即刻就已很明显，而癌细胞明显的结构改变最早见于光照后 6 小时左右。活体微循环观察可见光照开始后数分钟，微血管特别是小动脉的收缩就比较明显，局部血流减少。微血管内皮细胞最重要的功能之一是保持血液的正常流动。内皮细胞受 PDT 损伤后，细胞表面电荷消失，导致血细胞贴壁，血流紊乱；同时释放出许多花生四烯酸类物质，如血栓烷、前列腺素、白三烯 B4 等，导致血管收缩和通透性增加，血小板聚集，形成血栓，渗出增多，导致组织水肿。综合作用的结果是造成血流郁滞、血管闭合，靶细胞因缺氧和营养枯竭而死亡。

3. 免疫和炎性损伤

肿瘤组织中常有数量不等的各种免疫细胞存在。 PDT 可使人的中性白细胞迅速失去运动能力，大量钾离子外渗，琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、胱氨酸脱氢酶失活，继而酸性磷酸酶也失活。粒细胞受损后释出的氧自由基可损伤邻近的组织细胞，释出的蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶也可损伤邻近的组织细胞和结缔组织。 Evans 等报道，在体外条件下，应用 PDT 处理巨噬细胞，可导致肿瘤坏死因子 (tumor necrisis factor- ɑ ,TNF) 的释放。 TNF 可以导致肿瘤发生出血性坏死，但这一改变很难与 PDT 引起的细胞坏死相区别。当肿瘤组织中含有大量巨噬细胞时，促进 TNF 释放可能是 PDT 杀伤肿瘤细胞的重要机制。

此外初步的试验结果使有关专家确信，光动力作用使存活细胞产生新的抗原，能引起对于肿瘤的免疫反应。我们知道，恶性肿瘤使人致死的一个很重要的原因是它能转移病灶。如果用光动力治疗杀死原始肿瘤细胞 , 然后利用免疫系统控制其转移，就能够有效治愈癌症。对光动力治疗免疫机制的研究，同时也为利用自身免疫系统治疗癌症开辟了道路。

? 细胞的死亡形式

在多细胞生物中，细胞的死亡有两种不同的形式。一种是坏死，其形态特征首先是膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，染色体不规则移位，进而线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，细胞浆外溢。这种死亡过程常引起炎症反应。另一种称之为细胞凋亡，它是指细胞象秋天树叶凋谢一样自己结束生命，是多细胞生物清除病变或老化细胞的一种生理机制。细胞凋亡的典型特点是细胞首先变圆失去绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状，核染色质凝聚在核膜周边形成半月形的高密度区，进而胞膜内陷将细胞自行分割成有膜包裹的凋亡小体。它的结局是被邻周的细胞所识别、吞噬、或自然脱落而离开生物体。关于 PDT 导致细胞凋亡的研究始于 1991 年， Agarwal 首先报道 PDT 引起体外培养淋巴瘤细胞的凋亡，随后有多研究相继报告了 PDT 引起体外培养细胞或体内肿瘤细胞凋亡现象。

细胞凋亡有三种诱导途径：一是细胞表面受体介导途径，某些生物因子通过细胞膜表面的凋亡相关受体诱导细胞凋亡。这些受体包括肿瘤坏死（ TNF ）因子受体 -1 、 CD95(Fas/APO-1) TNF-related apoptosis-mediated protein 、 TNF-related apoptosis- inducing ligand receptor-1 和 -2 等。二是线粒体介导途径， 1 O 2 和活性氧物质（ ROS ）可以激活线粒体 megachannel ，使其释放凋亡蛋白（如细胞色素 C ），或刺激钙依赖酶（ calcccium-dependent enzymes ）的活性，如 calcccium-dependent 、 nuclease 和 phospholipase 等，诱导细胞凋亡。这是一条快速凋亡途径，凋亡所需要的各种因子都已存在，只需被激活，细胞凋亡一般发生在 PDT 或 UVA1 照射后 0.5 小时内。三是 DNA 损伤途径，此途径需要合成新的蛋白质，细胞凋亡一般发生在 PDT 、 PUVA 、 UVC 、 UVB 、 UVA 和 X 线照射完成４小时以后。

细胞在 PDT 作用后究竟是发生凋亡还是发生坏死，受多种因素影响，如细胞种类、状态、以及光敏剂的细胞内定位。定位于线粒体的光敏剂容体导致细胞凋亡，定位于细胞膜和溶酶体的光敏剂容易导致细胞坏死。 Methylene blue derivative 主要定位与线粒体，可以诱导 V79 中国仓鼠成纤维细胞凋亡。卟啉类光敏剂主要细胞膜和溶酶体的光敏剂，以导致细胞坏死为主。

细胞凋亡和细胞坏死的治疗意义在某些疾病是相同的，例如肿瘤和鲜红斑痣，只要能彻底杀伤、清除瘤细胞，或完全破坏鲜红斑痣的畸形毛细血管网，靶细胞结局是细胞凋亡还是细胞坏死并不重要。但对于某些疾病，如血管成型术后再狭窄，细胞凋亡和细胞坏死的治疗效果可能完全不同。虽然通过使细胞坏死和凋亡都能减少治疗区域的血管平滑肌细胞数量，但两者在活体情况下引起的继发反应则完全不同：细胞坏死因细胞内容物释放，导致局部产生炎症反应，刺激邻近部位的血管平滑肌细胞迁移至治疗区并持续增殖；细胞凋亡是通过胞膜内陷和细胞分割形成凋亡小体，最终被巨噬细胞吞噬，没有细胞内容物的释放，不产生炎症反应和随之发生的血管内膜过度增生。因此，研究 PDT 诱导细胞凋亡的机制和规律将有助于拓展 PDT 的临床治疗领域。

二、调节细胞功能

小剂量 PDT 具有生物刺激作用，可以促进细胞增殖。应用 PDT 处理血管平滑肌细胞，当功率密度为 20mW/cm 2 、照射时间 <15 秒时， PDT 对各 HMME 浓度组平滑肌细胞有轻度促增殖作用。 PDT 促细胞增殖效应的光参数范围较窄。这与 Gomer 等的报道相似。小剂量 PDT 促进细胞增殖的机理还不清楚。 Gomer 认为小剂量 PDT 可以改变线粒体的功能，从而产生促进细胞增殖的作用。

靶细胞在 PDT 作用后是否发生死亡，取决于光敏损伤程度。如果损伤程度超过细胞致死量，细胞将发生凋亡和坏死；如果损伤程度未达到细胞致死量，细胞可以启动修复机制，修复损伤。但细胞在修复损伤期间会表现出某种功能的抑制。例如 PDT 处理后，存活的 SMC 出现增殖、迁移和分泌功能的抑制达 72 小时以上。如何利用 PDT 的非致死性损伤以实现某种治疗目的，也是值得探索的问题。

三、对细胞外基质的作用

体外研究观察到，胶原纤维的水溶液在 PDT 作用后由于胶原纤维的聚合而形成凝胶。 PDT 对胶原纤维的主要作用是通过对氨基酸残基的光氧化使胶原纤维多肽链之间形成供价交联，胶原纤维之间发生聚合。但胶原纤维的形态和 periodicity 没有改变。这一作用有助于维持空腔脏器在 PDT 治疗后的完整性和强度，防止穿孔等并发症。研究表明，在 AlPcS 2n -PDT 处理后，大鼠结肠的强度无明显改变，破裂压为 108mmHg ，与正常结肠之间没有显著差别；电镜下可见，粘膜滤泡细胞消失，微血管破坏，但胶原纤维的结构无明显改变。但在热疗处理后，结肠的胶原纤维明显肿胀，破裂压为仅相当于前者的三分之一。在血管成型术后再狭窄的治疗中， PDT 促进胶原纤维交联的作用可以减少血管的弹性回缩，也可以防止血管瘤的形成。

用 PDT 处理血管细胞外基质，可使结合于细胞外基质的成纤维细胞生长因子活性降低 96% ，从而不能发挥其促血管平滑肌细胞增殖作用。因此 PDT 抑制再狭窄的机制不仅在于其细胞毒性，其改变细胞外基质的功能、灭活多种生物活性因子的效应亦发挥着重要作用。

四、免疫调节

研究表明，应用大剂量的局部 HpD-PDT 处理后，小鼠出现全身免疫抑制反应，表现有脾脏缩小、一过性 NK 细胞活性丧失 (nature killer cell) 等。目前认为，这一反应可能与 PDT 诱导的前列腺素释放有关。

体外骨髓移植净化研究发现， MC540 介导的光敏反应可抑制 T 和 B 细胞免疫，能抑制自身骨髓移植可引起免疫反应，也能明显降低异体骨髓移植时的免疫排斥反应。

类风湿关节的研究发现，光敏剂给药后对患病关节或更大范围区域进行激光照射，能选择性抑制血循环中或关节局部的免疫细胞活性，尤其是抑制 T 淋巴细胞的活性，从而抑制关节局部的细胞免疫反应。在佐剂诱导的 MRL-lpr 鼠 RA 模型的研究结果显示， PDT 能使关节肿胀明显减轻，血管翳形成减少，软骨损害减轻，同时蛋白尿及肾的组织病理学改变亦显著好于放射治疗组和消炎痛治疗组，且无明显副作用。在培养细胞的研究结果显示，激活的 T 细胞对光敏剂的摄取量较未激活的淋巴细胞高 5-10 倍，其功能在光照后被显著抑制。 PDT 对巨噬细胞也有类似的作用。